PMA-qPCR定量检测VBNC副溶血弧菌方法的建立与优化

作者：彭琳媛; 林洪; 王静雪^*

来源：食品与发酵工业, 2022, 48(01): 247-252.

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.027703

• 副溶血弧菌
• 活菌计数
• 叠氮溴化丙锭
• 荧光定量PCR
• 活的非可培养

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)在某些不利于生长的自然和食品加工条件下能够进入活的非可培养(viable but non-culturable, VBNC)状态，普通检测方式极易漏检，因此VBNC细菌检测技术的开发与优化对副溶血弧菌感染防控具有重要意义。基于叠氮溴化丙锭结合荧光定量PCR技术(propidium monoazide quantitative PCR,PMA-qPCR)能够利用活细胞的膜完整性区分活菌和死菌的原理，以副溶血弧菌ATCC 17802为对象，通过探讨PMA-qPCR方法中各项因素对活菌计数结果的影响，优化并建立了VBNC副溶血弧菌的定量检测方法。实验结果表明，当添加PMA质量浓度为15 mg/L,黑暗孵育10 min,再进行强光照射15 min后，死细胞的DNA扩增得到有效抑制，此时提取DNA模板进行qPCR扩增准确性更高，活菌数与qPCR扩增循环数呈现显著性线性相关(R2=0.99)。PMA-qPCR法测定副溶血弧菌活菌数的标准曲线显示该方法检测范围为2.90×101～2.90×108 CFU/mL,验证回收率在92.97%～99.57%,相对标准偏差为1.95%。该文建立了更加精准可靠的VBNC副溶血弧菌定量检测方法，为后续进一步探究提供了有效技术手段。

• 单位
  中国海洋大学