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摘要
目的 探讨调控Hippo信号通路在体内环境中促进间充质干细胞(MSC)修复急性呼吸窘迫综合征(ARDS)肺损伤的作用机制。方法 通过慢病毒载体转染构建低表达大肿瘤抑制因子2(LATS2)的小鼠骨髓MSC(mMSCs)细胞株。按照随机数字表法将6～8周龄雄性C57BL/6小鼠分为4组,每组36只。通过气道内注入2 g/L脂多糖(LPS)50 μL制备ARDS动物模型(ARDS组)；生理盐水(NS)对照组注入等体积NS。制模后4 h,通过气道移植5×104个含空干扰病毒转染的mMSCs(MSC-shcontrol组)或低表达LATS2的mMSCs(MSC-shLATS2组)；NS对照组和ARDS组则注入等量磷酸盐缓冲液(PBS)。制模后3、7、14 d分别处死小鼠并收集肺组织及支气管肺泡灌洗液(BALF),采用近红外荧光成像、免疫荧光染色及蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)评估mMSCs在肺组织的存留及向Ⅱ型肺泡上皮细胞(AECⅡ)分化情况；测定肺组织湿重/体重比值(LWW/BW)及BALF中总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)含量以评价mMSCs对肺水肿的改善效应；用Western Blot检测肺上皮紧密连接蛋白闭合蛋白(Occludin)的表达以反映mMSCs对上皮细胞通透性的影响；用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BALF中白细胞介素(IL-1β、IL-6、IL-10)水平以评估mMSCs对肺组织炎症反应的影响；对肺组织分别进行苏木素-伊红(HE)染色及改良Masson染色并评分以评估mMSCs对肺损伤的修复作用及对肺纤维化的影响。结果 MSC-shLATS2组3 d小鼠离体肺荧光图像信号强度即明显高于MSC-shcontrol组(荧光强度：0.039±0.005比0.017±0.002,P<0.05),肺组织内绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞数也明显高于MSC-shcontrol组(个/HP：29.65±6.98比17.50±4.58,P<0.05),但均随时间延长而递减；mMSCs向AECⅡ的分化比例也更高〔(64.12±15.29)%比(19.64±3.71)%,P<0.05〕。与NS对照组比较,ARDS组表面活性蛋白(SPC)、Occludin蛋白表达水平明显降低,LWW/BW比值及BALF中TP、ALB和炎性因子水平明显升高；肺组织可见广泛的肺泡及间质水肿、出血,弥漫性炎性细胞浸润,肺损伤评分显著增高；肺泡间隔和肺泡腔内可见明显的胶原纤维沉积,肺纤维化评分显著增高。与ARDS组比较,MSC-shcontrol组和MSC-shLATS2组14 d SPC、Occludin蛋白表达水平明显升高(SPC/β-actin：0.51±0.12、0.68±0.10比0.27±0.08,Occludin/β-actin：0.49±0.19、0.79±0.11比0.25±0.08,均P<0.05),3 d时BALF中TP、ALB、IL-1β、IL-6水平明显降低〔TP(g/L)：8.08±1.72、5.12±0.87比12.55±2.09,ALB(g/L)：0.71±0.21、0.44±0.18比1.18±0.29,IL-1β(ng/L)：99.26±14.32、60.11±8.58比161.86±25.17,IL-6(ng/L)：145.54±13.29、101.74±11.55比258.79±27.88,均P<0.05〕,IL-10水平明显升高(ng/L：190.83±22.61、316.65±37.88,均P<0.05),且MSC-shLATS2组各指标较MSC-shcontrol组升高或降低更为显著(均P<0.05)；MSC-shLATS2组LWW/BW比值明显低于ARDS组和MSC-shcontrol组(mg/g：9.85±1.51比16.78±1.92、14.88±1.74,均P<0.05)。结论 通过低表达LATS2抑制Hippo信号通路能促进mMSCs在ARDS小鼠肺组织内的存留及向AECⅡ细胞分化,改善肺水肿及肺泡上皮通透性,调控肺内炎症反应,减轻肺组织病理损伤及纤维化改变。
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单位无锡人民医院; 南京医科大学
