摘要
目的建立靶向人Beclin1非编码区小分子干扰(siRNA)的方法并对其效果进行评价。方法设计分别靶向人Beclin1 mRNA不同区域的siRNA:靶向5’-UTR的siRNA-#1、靶向3’-UTR的siRNA-3#和siRNA-4#,及靶向编码区的阳性对照siRNA-2#。各siRNA转染HEK293细胞48 h后,蛋白印迹法检测Beclin1及自噬标记蛋白LC3的变化;或者采用双荧光mRFP-GFP-LC3(tf LC3)质粒再转染24 h,荧光显微镜观察并统计细胞内红色及黄色LC3亮点的变化。结果转染siRNA后,特异靶向3’-UTR的siRNA-3#和siRNA-4#及靶向编码区的siRNA-2#(阳性对照)能显著抑制HEK293细胞的Beclin1和LC3的蛋白表达;并导致自噬体(黄色亮点)及自噬溶酶体(红色亮点)明显减少。结论采用靶向3’-UTR的特异siRNA可成功敲低(knock-down)人Beclin1的表达,并减少细胞自噬活性。成功建立的3’-UTR特异siRNA方法,为以后干扰和突变体共表达研究提供基础。
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