本发明提供一种Western Blot整膜多抗体孵育器,由密封夹、孵育袋以及孵育盒组成,所述孵育袋是两侧开口能够反复密封的塑料袋;所述密封夹能够从孵育袋的两侧开口的中间位置予以夹紧,使所述孵育袋被阻隔为两个独立空间;所述孵育盒的盒体具有两处柔性垫以及位于两处柔性垫之间的凹槽,所述凹槽可供所述密封夹放置,使置于所述两处柔性垫上的所述两个独立空间平置。本发明采用简便的方法,能够在一张完整PVDF膜上同时孵育内参蛋白和目的蛋白。