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摘要
目的研究泛素连接酶(Cbl-b)基因沉默对H9人T淋巴细胞免疫杀伤人喉鳞癌细胞Hep-2作用的影响和相关机制。方法选择12例喉鳞癌患和12例健康对照者,用磁性细胞分离技术分离外周血CD4+T细胞应用RT-PCR法检测Cbl-b的表达水平。同时,将人T淋巴细胞H9接种培养于96孔板,分为4组:以脂质体转染法将Cbl-b-siRNA重组序列转染人T淋巴细胞H9,作为Cbl-b-siRNA组;Cbl-b-siRNA重组序列转染T细胞成功后,在其培养液中加入IL-2中和抗体,作为anti-IL-2+Cbl-bsiRNA组;以脂质体转染法将随机阴性对照序列转染的人T淋巴细胞H9作为阴性组(NC组);以不做任何处理人T淋巴细胞H9为空白组(BC组)。采用倒置荧光显微镜观察人T淋巴细胞H9的转染效率、以实时荧光定量PCR法和蛋白免疫印迹法检测各组人T淋巴细胞H9中Cbl-b mRNA和蛋白表达情况。以细胞计数试剂盒(CCK-8)检测各组人T淋巴细胞H9对Hep-2细胞的杀伤作用;流式细胞仪检测各组人T淋巴细胞H9表面活化分子CD69、CD25阳性表达率;采用ELISA法检测T细胞上清液中白介素-2(IL-2)、γ干扰素(INF-γ)水平。结果 Cbl-b mRNA在喉鳞癌患者CD4+T细胞中表达升高,与健康对照差异有显著性(P<0.05)。Cbl-b-siRNA组和阴性组的转染效率分别为(78.30±6.06)%、(77.25±6.38)%,转染效果良好;Cbl-b-siRNA组人T淋巴细胞H9的Cbl-b mRNA和蛋白相对表达量与anti-IL-2+Cbl-b-siRNA组无显著差异(P>0.05),但显著低于空白组和阴性组(P<0.05);不同效靶比时,Cbl-b-siRNA组Hep-2肿瘤细胞杀伤率均显著高于anti-IL-2+Cbl-b-siRNA组、阴性组和空白组(P<0.05)。Cbl-b-siRNA组人T淋巴细胞H9表面活化分子CD69、CD25阳性表达率均显著高于anti-IL-2+Cbl-b-siRNA组、空白组和阴性组(P<0.05);Cbl-b-siRNA组人T淋巴细胞H9上清液中INF-γ、IL-2水平均显著高于空白组和阴性组(P<0.05);空白组与阴性组人T淋巴细胞H9的Cbl-b mRNA和蛋白相对表达量、肿瘤细胞杀伤率、表面活化分子CD69、CD25阳性表达率、上清液中IL-2、INF-γ水平比较差异均不显著(P>0.05)。结论应用siRNA技术沉默T细胞Cbl-b基因可有效增强人T淋巴细胞H9对人喉鳞癌细胞株Hep-2体外免疫杀伤作用,其机制可能与T细胞Cbl-b基因沉默促进人T淋巴细胞H9分泌IL-2、加强T淋巴细胞激活有关。
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