2014-2015年中国部分地区蜜蜂慢性麻痹病病毒流行病学调查及系统发育分析

作者：贾慧茹; 吴艳艳; 王强; 代平礼; 周婷

来源：中国农业科学, 2016, 49(10): 2017-2026.

• 意大利蜜蜂
• 慢性麻痹病病毒
• RT-PCR
• 系统发育树

【目的】前期笔者课题组对北京地区蜂群进行了常见病毒感染情况的调查,发现蜜蜂慢性麻痹病毒(Chronic bee paralysis virus,CBPV)在病蜂群中的检出率显著高于在健康蜂群中的检出率,据此推测可借助病蜂群对CBPV进行研究。鉴于目前国内CBPV流行病学数据的匮乏,论文旨在了解中国主要养蜂区病蜂群中CBPV的分布及遗传变异情况,以期为该病的防控提供依据。【方法】2014—2015年间从四川、安徽、浙江、河南、山东、山西、黑龙江、北京8个主要养蜂省(市)共采集到136份病蜂样品,采用RT-PCR法检测CBPV的感染情况。每份样品随机选取10只蜜蜂,取其头部,利用Trizol法提取样品的总RNA;通过凝胶电泳及Nanodrop ND-2000对总RNA的质量进行定性与定量检测。以样品总RNA为模板合成cDNA第一条链,而后以cDNA为模板扩增CBPV的特异性片段。所有扩增片段均进行琼脂糖凝胶电泳,对部分阳性样品进行测序与序列分析;通过扩增片段与阳性片段的比对确定每份样品中CBPV的检出情况。为研究CBPV中国分离株的系统发育特性,以样品cDNA为模板,扩增全部阳性样品的Rd RP基因(RNA-dependent RNA polymerase)特异性片段,而后进行测序与序列分析。将序列提交至GenBank获取基因登录号。对获得的分离株的Rd RP基因与GenBank上发表的相应序列进行比较分析,利用CLUSTAL W软件对全部参考序列及本研究获得的分离株的对应序列进行同源性比对,应用软件MEGA 6.0中邻接法(neighbor-joining)对所有序列绘制系统进化树。【结果】蜜蜂头部总RNA质量检测结果显示,所有样品的总RNA相对完整,且浓度处于(980.5±37.1)ng·μL-1范围内,A260/A280在1.92—2.24。CBPV感染率检测结果显示,136份病蜂样本中共检出120份CBPV阳性样品,阳性率高达88.2%。全部阳性样品的电泳结果可见与预期大小一致的特异性片段,其序列与靶序列同源性达到99%以上。Rd Rp基因特异性片段的序列分析表明,本研究共获得8个CBPV中国分离株,其序列与多种其他地区的CBPV的相应序列同源性达到97%以上。中国分离株GenBank登录号分别为KT374042—KT374049。对其系统进化树分析后可知,世界流行的CBPV分离株可分为5个进化分支:两个欧洲分支(European clade 1、European clade 2),两个中日混合分支(Chinese-Japanese clade 1、Chinese-Japanese clade 2)和一个美国分支(US clade)。获得的8个中国分离株均存在于同一进化分支上,且与之前得到的6个江苏分离株以及4个日本分离株共同形成两个混合分支。【结论】进一步证实了中国病蜂群中普遍存在CBPV感染;系统进化关系表明,目前国内CBPV分离株之间的遗传关系无明显地域性特征,与日本分离株亲缘关系较近。有关CBPV的监测工作亟需加强,且其预警作用需引起重视。

• 单位
  中国农业科学院植物保护研究所; 中国农业科学院蜜蜂研究所; 农业部; 植物病虫害生物学国家重点实验室