hSesn3基因真核表达载体的构建及在骨肉瘤细胞中的蛋白表达和定位

作者：沈涛; 郭洲洋; 李妍; 巴根; 陈之光; 郭然; 杨蕾; 付勤

来源：现代肿瘤医学, 2017, 25(17): 2699-2702.

DOI：10.3969/j.issn.1672-4992.2017.17.002

• hSesn3
• Western blot
• 绿色荧光蛋白
• 质粒构建

目的:通过构建人Sesn3真核表达载体同时证实融合蛋白在细胞中的表达及定位。方法:提取Hela工具细胞的mRNA,反转录至c DNA。进一步通过PCR来扩增人Sesn3基因的c DNA全长片段,并将其亚克隆于p EGFP-C1真核表达载体中,进而将构建的重组质粒进行酶切及测序鉴定,转染到MG-63骨肉瘤细胞中,获取细胞总蛋白,通过Western blot方法检测表达。进一步利用激光共聚焦扫描显微镜方法观察MG-63细胞内p EGFP-h Sesn3的定位,最后利用免疫沉淀方法纯化人源h Sesn3蛋白。结果:h Sesn3基因c DNA全长片段克隆于真核表达载体p EGFP-C1中,酶切鉴定片段为1 410 bp,并成功测序。Western blot检测到了GFP-h Sesn3融合蛋白表达,分子量约为79 k Da。在MG-63细胞中p EGFP-h Sesn3主要定位于细胞质,进一步成功纯化了h Sesn3蛋白。结论:成功构建了h Sesn3基因c DNA全长的真核表达载体,在MG-63细胞中p EGFP-h Sesn3蛋白主要定位于细胞质,最终成功纯化了h Sesn3蛋白。

• 单位
  中国医科大学附属盛京医院; 基础医学院; 中国医科大学