一种穿心莲内酯分离纯化方法,是一种集成采用溶剂除杂-溶剂萃取分离-柱层析-超临界流体抗溶剂结晶方法对穿心莲浸膏进行加工制备高纯穿心莲内酯单体。用氯仿除杂、乙酸乙酯萃取;柱层析填料(固定相)采用氧化铝等,流动相为正己烷与甲醇溶剂;超临界CO2抗溶剂结晶,结晶条件为:压力≤20MPa,温度≤80℃。产品含量最高可达99%以上。该分离纯化工艺,方法简便、成本低、易于工业生产应用。