奶牛CRY1基因真核表达载体构建、生物信息学分析及组织表达谱研究

作者：李丹; 张海森; 王逸群; 高登科; 赵泓淙; 李超; 靳亚平; 陈华涛^*

来源：中国畜牧兽医, 2023, 50(03): 870-881.

DOI：10.16431/j.cnki.1671-7236.2023.03.003

• 奶牛
• CRY1基因
• 生物信息学
• 组织表达谱

【目的】扩增奶牛隐花色素昼夜节律调节因子1(cryptochrome circadian regulator 1,CRY1)基因全长编码区(coding sequence, CDS),构建该基因的真核表达载体并对其进行生物信息学分析，检测奶牛CRY1基因的表达谱，为后续探究CRY1蛋白的生物学功能提供参考。【方法】以奶牛肝脏组织cDNA为模板，PCR扩增CRY1基因CDS区，将其与酶切线性化的pcDNA3.1-3HA空质粒以同源重组法连接，重组质粒命名为pcDNA3.1-3HA-cCRY1;利用在线软件对奶牛CRY1基因进行生物信息学分析。将空质粒pcDNA3.1-3HA和重组质粒pcDNA3.1-3HA-cCRY1转染至HEK293T细胞，利用Western blotting技术检测奶牛CRY1基因在蛋白水平的表达；利用实时荧光定量PCR检测CRY1基因在奶牛不同组织中的表达量。【结果】试验成功获得1 764 bp的奶牛CRY1基因CDS区序列，且成功构建pcDNA3.1-3HA-cCRY1真核表达载体。奶牛CRY1基因与牦牛、山羊、绵羊相似性在98%以上，且遗传距离较近。生物信息学分析表明，CRY1蛋白为碱性、亲水性蛋白，无跨膜结构与信号肽，存在45个潜在磷酸化位点，与CLOCK、ARNTL、FBXL3等多个蛋白存在互作。Western blotting结果表明，pcDNA3.1-3HA-cCRY1转染组在72 ku处出现明显的条带，而pcDNA3.1-3HA转染组在相应位置处无条带。实时荧光定量PCR结果表明，CRY1基因在奶牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏等10个组织中均有表达，其中在心脏中的表达量最高，在颈斜方肌中的表达量最低。【结论】本研究成功构建了CRY1基因的真核表达载体，且在HEK293T细胞中实现了CRY1蛋白的过表达。CRY1蛋白是一种不稳定的胞内蛋白，可与多种蛋白互作，并参与昼夜节律调控、细胞代谢、糖异生等过程。CRY1基因在牛、羊等反刍动物间较为保守，在奶牛多种组织中均有表达。研究结果为深入探究CRY1蛋白在奶牛生物钟系统中的转录调控机制提供参考依据。

• 单位
  西北农林科技大学