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摘要
ROP5与ROP18都是弓形虫重要的毒力因子，本研究旨在构建弓形虫RH株ROP5单基因缺失株，在此基础上构建ROP5与ROP18的双基因缺失株，并研究ROP5基因、ROP18基因的表型功能，为探究两个基因的协同作用奠定基础。首先构建质粒p SAG1:CAS9::Tg U6:sg ROP5、p ROP5::DHFR-D质粒，并将质粒电转至弓形虫RH株速殖子，经息疟定筛选及PCR鉴定；再将质粒p SAG1:CAS9::Tg U6:sg ROP18、p ROP18::CAT-D电转至鉴定正确的ROP5单基因缺失株（ROP5-KO）速殖子中，经氯霉素筛选并进行PCR鉴定。结果显示：本试验成功获得ROP5-KO株及ROP5与ROP18的双基因缺失株（ROP5/ROP18-KO）；两个基因同时缺失可明显降低弓形虫的入侵能力及生长速度；此外，双基因缺失后，弓形虫对小鼠的毒力明显减弱。本研究表明，同时敲除ROP5基因与ROP18基因后，弓形虫毒力显著降低，为进一步探究ROP5与ROP18的协同作用奠定了基础。
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