黏质沙雷菌非特异性核酸内切酶通用型定量检测方法的建立及验证

作者：毕华; 朱香; 卢宁; 牛林茹; 杨凌; 张晓峰; 周勇^*; 梁雅丽^*

来源：中国生物制品学杂志, 2022, 35(12): 1495-1505.

DOI：10.13200/j.cnki.cjb.003782

• 黏质沙雷菌
• 非特异性核酸内切酶
• ?核酸内切酶" name="keyword">Benzonase?核酸内切酶
• 双抗体夹心ELISA法

目的 建立黏质沙雷菌(Serratia marcescens)Benzonase?核酸内切酶(Serratia marcescens Benzonase? endonuclease,SMBE)通用型定量检测方法，并进行验证。方法 以突变体SMBE(第110位组氨酸突变为丙氨酸)基因BEHA为模板，PCR法扩增BEHA基因，插入至载体pET-20b(+)中，构建重组表达质粒pET-20b(+)-BEHA，经菌落PCR和测序鉴定。重组表达质粒转化E. coli BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达后进行一步Ni-NTA琼脂糖纯化树脂纯化，纯化产物经15%SDS-PAGE和分光光度计分析，并检测酶活性。用纯化BEHA免疫家兔，以获得的多克隆抗体作为包被抗体，标记HRP的多克隆抗体作为检测抗体，建立SMBE的双抗体夹心ELISA检测法。验证方法的线性范围、准确度、精密性，并确定定量限。采用建立的方法及市售试剂盒分别检测3个厂家生产的SMBE。结果 菌落PCR和测序鉴定证明，重组表达质粒pET-20b(+)-BEHA构建正确，第110位氨基酸成功突变为丙氨酸。BEHA的纯度> 95%，表达量为3 mg/100 mL，酶活性大幅降低。SMBE标准品在0～20 ng/mL范围内与A450呈良好的线性关系；16、10、0.6 ng/mL的SMBE标准品重复检测3次的偏差分别为-3.06%、-5.40%、3.33%;12和2 ng/mL的SMBE标准品重复10次检测结果 CV分别为2.48%和2.91%；定量限为0.2 ng/mL。与市售试剂盒比较，本研究建立的方法对3个厂家生产的SMBE检测结果更接近理论值。结论 建立的双抗体夹心ELISA法具有较好的准确度和精密性，该方法可定量检测多种市售SMBE产品，是一种SMBE的通用型定量检测方法。

• 单位
  中国食品药品检定研究院