EphB4基因重组慢病毒载体的构建及在结肠癌细胞中的表达

作者：张锦; 夏秋媛; 王建东; 周晓军

来源：医学研究生学报, 2014, 27(09): 905-908.

DOI：10.16571/j.cnki.1008-8199.2014.09.025

• EphB4
• 结肠癌
• 慢病毒
• 过表达

目的有研究显示EphB4表达异常在结肠癌发生发展中具有重要意义。文中通过构建慢病毒介导稳定过表达EphB4基因的结肠癌细胞株,以期为结肠癌的基因治疗提供一定的实验依据。方法通过PCR反应将人工合成的EphB4基因序列装入pcDNA3.1(+)载体,并通过测序验证重组克隆插入片段的序列信息。将质粒中扩增的目的基因片断克隆装入慢病毒表达载体pLenti6.3-MCS-IRES2-EGFP并进行基因测序以确认慢病毒载体是否成功构建。携带EphB4和EGFP基因的慢病毒通过阳离子脂质体转染293T细胞,收集富含EphB4基因的病毒颗粒上清液,梯度稀释后测定病毒滴度并感染人结肠癌细胞株SW480和Coca-2,通过药物筛选及维持构建稳定过表达EphB4基因的结肠癌细胞株。荧光显微镜下观察各组细胞中绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)表达情况,qPCR检测转染前后各组细胞中靶基因EphB4 mRNA,评价过表达效果。结果含有2964bp人EphB4基因编码区的慢病毒载体pLenti6.3-EphB4-IRES2-EGFP构建成功,基因测序结果完全正确,经慢病毒包装所得病毒上清液Lenti6.3-EphB4滴度为1×108TU/mL。稳转细胞株在荧光显微镜下可见GFP表达,qPCR实验证明转染后SW480及Coca-2细胞中EphB4 mRNA表达水平较转染前明显增加。结论成功扩增、克隆了EphB4基因,并建立其慢病毒表达系统,构建了稳定过表达EphB4基因的结肠癌细胞株,从而对于研究结肠癌的基因治疗提供了实验依据。

• 单位
  南京军区南京总医院