科研之友
微信
新浪微博
Facebook
分享链接
摘要
背景：研究报道敲低MKRN1可以抑制肿瘤细胞的生长，但MKRN1是否作为肿瘤相关蛋白在机体发挥作用还需进一步研究。由于siRNA介导的基因沉默是瞬时表达，持续时间短且常规慢病毒技术存在脱靶效应，利用四环素调控(Tet-on)慢病毒系统构建稳定沉默MKRN1基因的细胞系有着可逆的优势，且可规避上述缺点，对于深入研究MKRN1的生物学功能有重要的意义。目的：构建Tet-on慢病毒系统介导的MKRN1基因沉默载体，研究沉默MKRN1基因表达对人胚胎肾细胞HEK-293T增殖、凋亡的影响。方法：采用RNAi技术，针对MKRN1基因设计3条shRNA(命名为sh1,sh2,sh3)，将3条shRNA序列连入四环素诱导表达载体pTripz中验证连入序列；通过三质粒系统转染HEK-293T细胞，并用含有1 mg/L强力霉素的完全培养基培养，进行慢病毒包装，收取48 h及72 h病毒液，将其浓缩后感染HEK-293T细胞，感染48 h后用荧光显微镜观察病毒感染效率。通过实时荧光定量PCR、Western blot检测MKRN1的敲减效率；Western blot检测四环素诱导表达系统是否构建成功；通过集落形成实验及Western blot检测沉默MKRN1表达后对HEK-293T细胞增殖、凋亡能力的影响。结果与结论：(1)设计的3条MKRN1-短发夹RNA(sh1、sh2、sh3)，均成功连入Tet-on载体，且各组载体序列正确；通过慢病毒成功感染HEK-293T细胞；(2)实时荧光定量PCR及Western blot检测发现3条shRNA序列中1号序列敲低MKRN1水平明显降低(P <0.05)，且沉默组不加入强力霉素诱导后目的基因的表达得到回复；(3)集落形成实验发现沉默MKRN1后HEK-293T细胞增殖能力下降(P <0.05);Western blot检测敲低MKRN1后，增殖细胞核抗原表达下调，细胞凋亡相关指标BAX表达增加，Bcl2表达下调，Bcl2/BAX的比值下调(P <0.001)；(4)结论：采用Tet-on慢病毒载体系统构建了稳定沉默MKRN1的HEK-293T细胞株，且沉默MKRN1后能够抑制HEK-293T细胞的增殖，并促进其凋亡。通过构建稳定沉默MKRN1的HEK-293T细胞可为进一步研究MKRN1的生物学功能奠定基础，也为研究其他基因的生物学功能提供一个方法学上的参考。
- 单位
