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摘要
右旋糖酐酶（Dextranase,E.C.3.2.1.11）是一种专一性催化断裂右旋糖酐中的α-1,6糖苷键的水解酶,催化产物包括异麦芽糖、低聚异麦芽糖、低聚右旋糖酐等,该酶及其产物广泛应用于医药、食品、化工等领域。1.右旋糖酐酶产生菌的筛选我们实验室从土壤中筛选获得了两株高产右旋糖酐酶的菌株H5和H6,通过形态特征和ITS rDNA序列分析鉴定,H5为棘孢青霉（Penicillium aculeatum）,Genbank登录号为HQ647326,H6为嗜松青霉（Talaramycespinophilis）,Genbank登录号为KF751644。首先分别对两种来源的右旋糖酐酶粗酶液进行分离纯化得到纯酶,SDS-PAGE测得H5右旋糖酐酶分子量为66kDa,H6右旋糖酐酶分子量为58kDa。随后对两种酶的酶学性质做了初步研究,棘孢青霉右旋糖酐酶的酶促反应的最适温度为35℃,最适pH为6.0,Cu2+和Zn2+对酶活有较强的促进作用,低浓度的Cu2+能使酶活提高到134.7%;嗜松青霉右旋糖酐酶的最适反应温度为45℃,最适pH为6.0,并且在pH3.0-10.0范围内稳定并具有良好的热稳定性,SDS和UJrea对该酶有明显的促进作用,其中高浓度的SDS和低浓度的Urea均能够使该酶活力提高约15%,与棘孢青霉右旋糖酐酶不同的是Zn2+、Cu2+对该酶具有强烈的抑制作用。两种右旋糖酐酶的酶解产物均为异麦芽糖和异麦芽三糖,说明这两种酶均为内切型右旋糖酐酶。2.低聚右旋糖酐的制备通过研究右旋糖酐酶的催化性能,建立分子量可控的低聚右旋糖酐生产工艺,棘孢青霉右旋糖酐酶制备的右旋糖酐T70、T40、T20总收率达80.32%,嗜松青霉右旋糖酐酶制备的T70、T40、T20、T10总收率达82.60%,并且与商业右旋糖酐对比研究发现,酶法催化制备的右旋糖酐分布系数更低,分子量分布集中,并且具有更好的水溶性。右旋糖酐酶通过催化降解右旋糖酐蔗糖酶合成的高分子量右旋糖酐来合成具有药用功能的低聚右旋糖酐,因此为定向制备低聚右旋糖酐,我们对右旋糖酐酶和右旋糖酐蔗糖酶双酶联合催化体系进行了研究,研究发现当双酶同时加入低浓度的蔗糖溶液中进行催化时,得到的系列右旋糖酐分子量以5kDa的产品为主体,当右旋糖酐酶在右旋糖酐蔗糖酶催化的过程中介入时,得到的系列产品则以分子量20kDa和10kDa为主体。将双酶协同作用于高浓度的蔗糖溶液中时,也能得到分子量为5kDa10kDa的低聚右旋糖酐。3.低聚右旋糖酐性质表征随后我们利用红外光谱与核磁共振波谱技术对右旋糖酐官能团以及糖苷键进行分析,商业右旋糖酐T70为对照,棘孢青霉制备的T4、嗜松青霉制备的T70和T10、双酶协同制备的T7为实验对象,红外光谱发现五种样品的吸收峰基本一致,说明不同方法制备的不同分子量的右旋糖酐具有相同的官能团。1H NMR谱图中,不同糖苷键组成的多糖分子上C1上质子峰面积之比代表着各种糖残基的比例,4.93ppm处的质子峰代表糖苷链上的α-1,6-糖苷键,5.20ppm处的质子峰则代表了糖苷链中的α-1,3-糖苷键,对这两个位移处的质子峰面积进行积分比较发现酶法制备的右旋糖酐糖苷键比例均在95%左右,与商业右旋糖酐糖苷键比例保持一致。4.低聚异麦芽糖的制备低聚异麦芽糖是一种功能性寡糖,在食品、保健品等行业有重要作用,研究表明右旋糖酐蔗糖酶的转糖基反应,以及用酸或者右旋糖酐酶催化降解高分子葡聚糖能够得到不同聚合度的低聚糖。为更好的制备低聚糖,联合右旋糖酐蔗糖酶的转糖基反应与右旋糖酐酶催化反应制备低聚糖。首先对双酶协同催化规律进行分析,然后对低聚糖的制备进行液相定性追踪与电泳检测,结果表明:右旋糖酐单酶降解右旋糖酐20得到的酶解产物主要是DP2-15的低聚糖和DP>15的低聚右旋糖酐;酶解速率与右旋糖酐酶的用量成正比;酶解产物中葡萄糖含量很低,并且可以通过调控避免葡萄糖的生成,这与酸解相比具有明显的优势。而双酶催化蔗糖合成的低聚糖产物聚合度DP在2-10之间,富含DP2-DP5的功能性糖分,同时含有部分葡萄糖;反应前期主要以右旋糖酐蔗糖酶合成右旋糖酐为主,后期则以右旋糖酐酶的降解反应为主,双酶体系中优先进行右旋糖酐的合成。双酶合成与单酶降解相比,合成的低聚糖功能性糖分高,益生元特性更好。5.右旋糖酐酶防止龋齿变异链球菌是牙菌斑中的优势菌,具有很强的产酸、耐酸能力,是主要的致龋菌,该菌能合成水溶性胞外多糖介导细菌的粘附和生物膜的形成。因此考察了H5和H6两种右旋糖酐酶对这种多糖生物膜的降解作用,以及对变异链球菌生长的干扰作用,发现两种右旋糖酐酶都能在一定程度上抑制变异链球菌形成牙菌斑,并且对合成的牙菌斑黏膜具有一定的清除作用。并且微生物安全性实验表明这两种右旋糖酐酶均不具有微生物毒性,说明两种右旋糖酐酶均能在一定程度上防止龋齿。6.右旋糖酐酶基因的克隆表达为更深入的研究右旋糖酐酶,我们以棘孢青霉基因组为模板,反转录合成cDNA,密码子优化后,将该基因序列克隆到毕赤酵母X33中,通过高抗性以及特异性筛选,获得了一株高产右旋糖酐酶的重组毕赤酵母,说明毕赤酵母适合右旋糖酐酶基因的外源表达。综上,我们筛选获得的两株右旋糖酐酶,具有较好的温度稳定性以及pH耐受性,通过调控催化条件可制备不同分子量的右旋糖酐以及不同聚合度的低聚异麦芽糖。并且实现了右旋糖酐蔗糖酶、右旋糖酐酶双酶级联反应制备低聚糖酐和低聚糖。右旋糖酐酶还能在一定程度上降解牙菌斑生物膜,防治龋齿,具有重要的应用价值。为进一步研究该酶特性,己成功将右旋糖酐酶基因克隆达毕赤酵母中,并成功表达。
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