胰岛素降解酶突变体T142A的原核表达及其活性检测

作者：肖树; 黄晨; 马树涛; 张凯; 李依萌; 李真; 陆昌瑞; 陈婷^*

来源：中国生物制品学杂志, 2023, 36(08): 924-929.

DOI：10.13200/j.cnki.cjb.003969

• 胰岛素降解酶
• 点突变
• 突变体T142A
• 原核表达
• 酶活
• 活性残基

目的 原核表达胰岛素降解酶(insulin-degrading enzyme,IDE)突变体T142A，并检测其活性。方法 结合多序列比对结果和IDE底物共晶体结构，预测IDE的β6-strand结构中的活性残基。采用点突变技术将IDE的第142位苏氨酸替换为丙氨酸，构建重组质粒ppSUMO-T142A，通过E.coli系统表达后，经镍离子柱亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析纯化，获得突变体T142A，荧光法测定其活性。结果 IDE氨基酸序列在16个物种间高度保守，T142直接参与底物结合，并与底物剪切位点相互作用，且靠近催化活性中心和门亚结构域等重要结构。经测序鉴定，证明重组质粒ppSUMO-T142A突变正确。表达的融合蛋白His-SUMO-T142A相对分子质量约131 000，主要以可溶形式存在于上清中，浓度为18 mg/mL；经3步纯化获得突变体T142A的纯度达86%。T142A催化降解荧光底物Substrate V的最大反应速率(Vmax)为501.06 min-1，米氏常数(Km)为9.01μmol/L，与野生型IDE(Vmax为2 814.32 min-1,Km为11.93μmol/L)比较，活性大幅下降。结论 本研究表达的IDE突变体T142A活性大幅降低，T142是IDE发挥活性功能的重要残基，为新型IDE活性调控分子的研发提供了实验依据。

• 单位
  东华大学; 生物工程学院