反相高效液相色谱法检测白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白纯度

作者：何刚; 黄杰; 孙俊; 魏鑫; 冯树宏; 侯文礼^*

来源：微生物学免疫学进展, 2023, 51(02): 34-40.

DOI：10.13309/j.cnki.pmi.2023.02.005

• 白喉毒素
• 无毒突变体
• CRM197蛋白
• 纯度
• 反相高效液相色谱法
• 结合疫苗

目的 建立反相高效液相色谱法(reverse phase high performance liquid chromatography, RP-HPLC)检测白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白纯度。方法 利用Agilent AdvanceBio RP-mAb SB-C8(100 mm×2.1 mm)分析柱和Agilent1260高效液相色谱系统，以含0.1%三氟乙酸水溶液-异丙醇(98∶2)为流动相A,以含0.1%三氟乙酸乙腈溶液为流动相B,进行梯度洗脱，体积流速为0.5 mL/min,检测波长为280 nm,柱温为65℃,进样体积为10μL,采用面积归一法检测CRM197蛋白纯度，并对方法的适用性、专属性、重复性、中间精密度、线性、灵敏度和耐用性指标进行考察。用建立的方法检测CRM197蛋白酸处理供试品溶液、碱处理供试品溶液及3批原液的纯度。结果 建立的方法系统适用性良好；专属性验证表明空白溶液在目标峰积分范围内无干扰峰，热处理CRM197蛋白目标峰与其他杂质峰分离度>1.5;6次重复进样目标峰面积相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为1.14%,保留时间RSD为0.81%;中间精密度分析目标峰面积RSD为1.62%,保留时间RSD为0.06%;CRM197蛋白含量在20～2 000μg/mL范围内，与峰面积存在良好的线性关系(R2=0.999 8);最低检测限为10μg/mL,定量限为20μg/mL;在改变柱温色谱条件时，目标峰面积百分比与保留时间均RSD≤5.00%,耐用性研究合格。对酸处理、碱处理供试品溶液及3批原液进行纯度检测，纯度在76.5%～96.9%,结果准确。结论 建立的RP-HPLC检测CRM197蛋白纯度的方法，经验证各项指标均符合要求，可用于CRM197蛋白的纯度检测。