基于跨反向剪接位点引物特异性检测circRNA的PCR方法

作者：孙宝箴; 全龙萍; 康慧; 姚玉新; 沈甜; 陈卫平; 杜远鹏; 高振^*

来源：生物技术通报, 2022, 38(05): 279-285.

DOI：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0746

• circRNA
• qRT-PCR
• 背向引物
• 可变反向剪接

为了特异扩增circRNA发生可变反向剪接环化事件时被包含的circRNA，准确分析目标circRNA的表达水平。首先通过生物信息学分析葡萄高可信度circRNA的可变反向剪接环化事件特征，提出一种适用于葡萄circRNA可变反向剪接环化事件的引物设计改良方法，即一端引物的3’端跨反向剪接位点3-4个碱基，并运用RT-PCR和qRT-PCR方法进行验证。结果表明，高可信度葡萄circRNA的来源基因中有21.7%存在可变反向剪接环化事件，可分为并列、交叉和包含关系。选取4组circRNA进行扩增，其中circRNA＿4363、circRNA＿6017、circRNA＿6044和circRNA＿7086分别被circRNA＿4364、circRNA＿6018、circRNA＿6045和circRNA＿7085包含，使用常规背向引物对被包含的4个circRNA进行RT-PCR可获得2条扩增条带，且qRT-PCR溶解曲线为双峰。通过应用改良引物对circRNA＿4363、circRNA＿6017和circRNA＿7086进行RT-PCR和qRT-PCR可获得单一扩增产物。相较于常规背向引物，使用改良引物可以特异扩增发生可变反向剪接环化事件时被包含的circRNA，使其定量分析结果更加准确可靠。

• 单位
  作物生物学国家重点实验室; 宁夏农林科学院; 山东农业大学