MITF基因重组真核细胞表达质粒的构建、表达及意义

作者：张华; 冯娟; 李家大; 罗浑金; 陈红胜; 梅凌云; 贺楚峰; 冯永

来源：中华耳科学杂志, 2014, 12(01): 136-141.

DOI：10.3969/j.issn.1672-2922.2014.01.032

• Waardengurg综合征
• MITF
• 基因突变
• 分子克隆技术
• 体外实验

目的通过构建基因MITF及其突变体表达质粒初步研究其外源性表达和定位表达,为研究Waardenburg综合征(Waardenburg syndrome,WS)发病机制提供一定的实验依据和基础。方法通过分子克隆技术双酶切pCMV-MITF和pCMV-Flag后连接构建MITF基因重组真核细胞表达质粒pCMV-MITF-Flag,以其为模板分别构建MITF基因新发突变R217I和T192fs表达质粒pCMV-R217I-Flag和pCMV-T192fs-Flag,DNA测序鉴定。MITF、R217I和T192fs表达质粒分别瞬时转染NIH3T3细胞或黑色素瘤UACC903细胞,Western blot和细胞免疫荧光分别检测和观察野生MITF蛋白和突变R217I、T192fs蛋白的表达和分布。结果 MITF及其突变体R217I和T192fs表达质粒经DNA测序鉴定序列正确,三者在黑色素瘤UACC903细胞中正确表达,MITF和R217I仅在细胞核中分布,而T192fs仅在细胞质分布。结论成功构建了MITF基因及其突变体真核细胞表达质粒,突变对MITF蛋白的亚细胞定位产生影响,为在体外实验进一步研究国人MITF基因突变致WS发病的分子机制奠定了实验基础。

• 单位
  中南大学; 新疆医科大学第一附属医院; 医学遗传学国家重点实验室; 中南大学湘雅医院