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摘要
从‘Athlone’萱草(Hemerocallis fulva)中克隆了细胞质、细胞壁和液泡蔗糖转化酶基因各1个,命名为HfCIN3、HfCWIN1和HfVIN1,其ORF分别为1941、1701、1920bp,编码646、566和639个氨基酸,氨基酸序列相似性为18.81%～41.86%。HfCIN3与石斛、野香蕉等的氨基酸序列相似性为75.16%～82.79%,Hf CWIN1与芦笋、油棕榈等的相似性为58.95%～68.88%,HfVIN1与龙舌兰相似性为73.4%。HfCIN3具有信号肽和典型的β-fructofuranosidase domain、glycoside hydrolase family 100结构域,而HfCWIN1和HfVIN1有glycosyl hydrolases family 32特征结构域,Hf CWIN1还含有72个氨基酸与细胞壁糖分子识别有关的Malectindomain,HfVIN1含有可能的液泡识别motif"ILPD",并在N端有典型跨膜结构。HfCWIN1和HfVIN1同时存在N–糖基化位点和O-β-GlcNAc糖基化位点,HfCIN3仅有O-β-GlcNAc糖基化位点。系统进化分析显示,在不同类型转化酶分支里,可以较清楚地区分单子叶和双子叶植物,CWIN和VIN之间的亲缘关系较近,HfCIN3、Hf CWIN1、HfVIN1聚于单子叶植物分支。瞬时表达分析显示,35S:HfCIN3-GFP在叶绿体中表达,35S:HfVIN1-GFP在液泡中表达,35S:HfCWIN1-YFP在细胞壁、保卫细胞中均有明显表达。HfCIN3、HfCWIN1、Hf VIN1在萱草叶片中的表达水平显著高于根和花组织,在叶片中表达水平HfVIN1> HfCWIN1> HfCIN3。0℃处理24 h后,HfVIN1的表达水平较5℃上调2.2倍,HfCWIN1的表达也显著上调,HfCIN3的表达水平峰值出现在5℃,其他两个基因表达峰值出现在0℃。5%或10%PEG处理24 h后,Hf CIN3和Hf VIN1的表达水平与对照差异不显著,HfCWIN1显著低于对照。在不同组织中CIN酶活性与基因表达结果基本一致,而其他两种酶与基因表达不一致;随着温度降低,叶片中CIN酶活性整体呈下降趋势,CWIN先升高后降低,VIN先下降后升高再下降;PEG可以诱导VIN活性上升。低温和渗透胁迫处理后酶活性与基因表达存在不同步现象,推测基因转录后修饰和翻译后修饰对转化酶活性起着重要作用。本结果证实萱草3种转化酶的亚细胞定位明显不同,不同组织间基因表达有较大差异,HfVIN1响应低温胁迫,HfCWIN1响应渗透胁迫。
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