副溶血弧菌耐热直接溶血素DAS-ELISA检测方法的建立

作者：白雪欣; 胡宸艺; 金志颖; 万伟; 李月; 王菁; 李岩伟; 高姗^*; 王景林^*

来源：中国人兽共患病学报, 2022, 38(08): 666-672.

• 耐热直接溶血素
• 多克隆抗体
• DAS-ELISA

目的 建立副溶血弧菌耐热直接溶血素的双抗体夹心ELISA (double antibody sandwich ELISA,DAS-ELISA)检测方法。方法 本研究通过PCR技术扩增副溶血弧菌耐热直接溶血素基因序列，并将其克隆至pET-28a载体后进行原核表达，对表达蛋白进行纯化和鉴定，随后用高纯度的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体，得到抗体后利用分子互作测定抗体的亲和力，并利用该抗体建立检测副溶血弧菌耐热直接溶血素的DAS-ELISA方法。通过棋盘法对该方法的反应条件进行优化，建立标准曲线，并对建立的DAS-ELISA方法进行性能评价及初步应用。结果 本实验制备的多克隆抗体亲和力可达1×10-8,使用该高亲和力抗体建立的DAS-ELISA方法灵敏度为78 ng/mL,定量范围为78～312 ng/mL;与创伤弧菌溶细胞毒素(Vibrio vulnificus hemolysin, VVH)、产气荚膜梭菌α毒素(Clostridium perfringensαtoxin, CPA)以及产气荚膜梭菌ε毒素(epsilon toxin, ETX)均无交叉反应；利用扇贝、花蛤和魁蚶制备海鲜模拟样本，在上述3种模拟样本内添加重组蛋白构建标准曲线，评价本方法复杂基质中检出能力时发现灵敏度均并未发生改变；同时在上述3种模拟样本中添加菌液上清评价本方法检测天然毒素能力，检出率为100%。结论 成功构建了一种用于副溶血弧菌耐热直接溶血素检测的DAS-ELISA方法，该方法特异性强、灵敏度高，适用于复杂基质检测，有望开发成副溶血弧菌耐热直接溶血素快速诊断试剂盒，具有良好的应用前景。

• 单位
  安徽医科大学; 基础医学院; 病原微生物生物安全国家重点实验室