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摘要
【目的】微小RNA(microRNA,miRNA)是一类在转录后水平对mRNA进行负调控的关键调控因子。本研究旨在通过分析意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)幼虫肠道发育过程中差异表达miRNA(differentially expressed miRNA,DEmiRNA)及其调控网络,提供miRNA的表达谱和差异表达信息,揭示DEmiRNA在幼虫肠道发育中的作用。【方法】利用small RNA-seq(sRNA-seq)技术对意蜂4、5和6日龄幼虫肠道样品(Am4、Am5和Am6)进行测序,将质控后的数据与西方蜜蜂(Apis mellifera)参考基因组进行比对,然后将比对上的序列标签(tags)注释到miRBase数据库,并利用TPM(tags per million)算法归一化处理所得miRNA的表达量,再通过相关生物信息学软件对miRNA进行表达量聚类、前体二级结构预测及差异表达分析。利用TargetFinder软件预测DEmiRNA的靶基因,使用Blast软件对靶基因进行GO和KEGG数据库注释,进而通过Cytoscape软件构建mi RNA-m RNA的调控网络。采用茎环实时荧光定量PCR(Stem-loop RT-qPCR)验证测序数据的可靠性。【结果】意蜂幼虫肠道样品的测序分别得到10 841 644、12 037 678和9 230 496条有效序列标签;Am4 vs Am5比较组包含16个上调和10个下调mi RNA,Am5 vs Am6比较组包含5个上调和7个下调mi RNA。其中,novel-m0031-3p为两个比较组所共有,并结合5个与蜕皮激素诱导蛋白相关的靶基因;二者的特有DEmi RNA数分别为25和11个。Am4 vs Am5的26个DEmi RNA结合5 742个靶基因,其中2 725个靶基因可注释到GO数据库中的46个GO term,并主要富集在结合、细胞进程、代谢进程和单组织进程等;Am5 vs Am6的12个DEmi RNA结合3 733个靶基因,且其中2 725个靶基因富集在结合、细胞进程、单组织进程和代谢进程等41个GO term;此外,两个比较组中的DEmi RNA分别有1 046和676个靶基因可注释到116和92条KEGG代谢通路,且Am4 vs Am5比较组的DEmi RNA的靶基因富集在Wnt信号通路、Hippo信号通路、嘌呤代谢和内吞作用等通路上的数量均高于Am5 vs Am6比较组。进一步分析结果显示Am4 vs Am5中的上调和下调mi RNA可分别结合611和85个靶基因,其中ame-mi R-6052结合的靶基因数最多,可通过结合5个靶基因,参与对细胞色素P450的调控;mi R-281-x结合49个靶基因,并间接调控组氨酸代谢、TGF-β信号通路以及Hippo信号通路;Am5 vs Am6中的上调和下调mi RNA可分别结合43和431个靶基因,其中mi R-iab-4-x结合靶基因数量最多,并广泛参与调控背腹轴的形成、Hippo信号通路、Wnt信号通路、Fox O信号通路、Notch信号通路以及m TOR信号通路等与生长发育相关的通路。调控网络分析结果表明,DEmi RNA与靶基因间形成较为复杂的调控网络,DEmi RNA居于调控网络的中心位置,而m RNA位于调控网络的外周。最后,通过茎环实时荧光定量PCR对随机选取的3个DEmiRNA进行验证,结果证实了测序数据的可靠性。【结论】在全基因组水平对意蜂幼虫肠道的DEmi RNA及其靶基因进行预测和分析,并对DEmi RNA的调控网络进行构建及分析,发现意蜂幼虫通过调节包括ame-mi R-6052、miR-iab-4-x、mi R-281-x和novel-m0031-3p在内的多个mi RNA的表达水平对肠道生长和发育进行调控,研究结果不仅提供了意蜂肠道发育过程的mi RNA表达谱及差异表达信息,也为阐明意蜂幼虫肠道的发育机理打下基础。
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