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摘要
目的 Eha是一种重要转录调控因子,它可以影响迟缓爱德华氏菌(Et)的胞内存活,本实验探究Eha直接调控的靶基因如何抵御巨噬细胞杀灭细菌的分子机制。方法构建pGEX-4T-ehaflag重组质粒,电击导入eha基因缺失株的ET-13菌,得到Cehaflag ET13重组菌;用Western blot检测重组菌Eha-Flag融合蛋白的表达,并用细菌胞内存活实验检测细菌EhaFlag融合蛋白的活性;我们釆用染色质免疫共沉淀(CHIP)技术,用抗Flag标签抗体对靶基因沉淀Eha-DNA片段,除去结合的蛋白并纯化DNA片段;以RNA-Sequencing的差异表达基因设计引物,以CHIP得到的DNA样品为模板,进行qRT-PCR; PCR扩增靶基因的启动子区域,构建了pBAD-P靶lac Z重组质粒,电击分别导入ET-13野生株和eha基因缺失株,比较它们β-半乳糖苷酶活性的差异;SDS-PAGE电泳比较野生株和缺失株外膜蛋白、厌氧C4二羧酸转运蛋白DcuA1和鞭毛钩蛋白FlgK表达的差异,并用细菌胞内存活实验比较野生株和缺失株的差异。结果 Western blot表明,Cehaflag ET13重组菌能够表达Eha-Flag融合蛋白;细菌胞内存活实验表明,该融合蛋白完全可以恢复缺失株在胞内降低的生存能力,Flag融合标签不影响Eha蛋白的功能;通过qPCR鉴定CHIP,富集到Eha的结合靶点,最终筛选出10个Eha直接结合的基因;通过野生株和缺失株中β-半乳糖苷酶活性的差异,证明eha基因对5个靶基因启动子有直接调控作用;通过检测野生株和缺失株表型的差异,证明eha基因对靶蛋白DcuA1,TnaA和FlgK的表达和活性有调控作用。结论 Eha可以通过直接调控这些靶基因,使Et菌在巨噬细胞内的存活受到影响。
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