PCR?RFLP法检测MTRR基因A66G多态位点的改进

作者：何震宇; 顾取良; 陈瑜丽

来源：分子诊断与治疗杂志, 2021, 13(10): 1701-1704.

DOI：10.3969/j.issn.1674-6929.2021.10.037

• 甲硫氨酸合成酶还原酶
• 基因分型
• 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性

目的 对现有检测MTRR基因A66G多态位点的PCR?RFLP法进行改进,避免因NdeI酶切不完全可能导致的基因型误判.方法 设计1对PCR引物,上游引物3′端倒数第3位含错配碱基,下游引物结合位置位于一个天然的Nde I识别序列(CATATG)72 nt之后,使用该对引物扩增包含MTRR基因A66G多态位点的靶序列,将多态位点相关的原序列AATRTG(R为多态位点碱基A/G)变为CATRTG,以便通过限制性核酸内切酶Nde I消化来甄别多态位点碱基具体为A还是G,多态位点下游315 nt处含有天然的Nde I识别序列作为内对照酶切位点,PCR产物用Nde I消化制作限制性酶切图谱以判断基因型.结果 PCR可成功扩增预期大小为478 bp的靶片段,在用Nde I消化PCR产物制作而成的限制性酶切图谱中,凭借小于PCR产物的2种特征性酶切条带可明确判断各样品基因型,即便酶切不完全即出现PCR产物残留或酶切中间产物时,基因型的判断也不受干扰,分型结果得到基因测序支持.使用该法检测了100例样品,检得MTRR基因A66G多态位点3种基因型即AA、AG、GG的频率分别为0.57、0.34、0.09;A和G等位基因频率分别为0.74和0.26,符合Hardy?Weinberg遗传平衡(χ2=1.355,P=0.508).结论 本方法由于内对照酶切位点的引入,能克服传统PCR?RFLP法使用Nde I酶检测MTRR基因A66G多态位点酶切不完全可能导致的基因型误判.