对脲酶Km值简易测定方法中存在的问题和(NH4)2SO4标准溶液浓度、尿素浓度、脲酶终止剂、缓冲液系统以及脲酶用量等因素对Km值的影响,进行了多组对比测定。将该方法测定条件优化为:(NH4)2SO4标准溶液浓度0.001mol·L-1,尿素浓度1/250、1/200、1/150、1/100、1/50mol·L-1,终止剂10%硫酸锌,缓冲液1/15mol·L-1Tris-H2SO4(pH7.0),脲酶用量0.50mL。