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摘要
背景:糖尿病肾脏病(Diabetic Kidney Disease,DKD)是糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)最主要的微血管并发症之一,是导致终末期肾病(End-stage renal disease,ESRD)和最终死亡的主要原因。目前关于DKD的发病机制尚不完全清楚,主要涉及遗传和环境因素,同时也与持续高血糖状态、炎症反应、氧化应激、肾脏纤维化等多种机制有关。目前关于DKD的治疗主要以控制血糖、服用RAAS抑制剂治疗为主,但无法有效遏制病程进展。故而,如何有效阻止/延缓DKD的病程进展,是目前需要解决的迫切问题。现代中医认为DKD属于“消渴肾病”的范畴,认为DKD发病因素主要为先天不足,过食肥甘,脏腑虚损,劳欲伤肾。病机为血瘀痰浊、肝肾阴虚,郭宏敏教授依据其病机特点,自拟“龙杞方”对症治疗,其临床疗效显著,能有效控制DKD患者的血糖及肾脏进一步恶化的情况,但由于龙杞方由多味中药组成,药物的有效成分和药效物质较为复杂,因此,如何简化龙杞方的有效成分,了解龙杞方治疗DKD的核心靶点,主要成分及信号通路是本次研究的关键,同时也为中药新药的研发关于阻止/延缓DKD治疗提供新的研究思路。目的:1.基于GEO芯片数据库、网络药理学方法、分子对接技术探讨龙杞方治疗DKD的分子生物学机制,筛选出龙杞方治疗DKD的信号通路、核心靶点及有效成分。2.从动物实验的角度对筛选出的核心靶点进行验证,进一步从证实龙杞方治疗DKD的作用机制。研究方法:1.通过GEO芯片数据库检索获得GSE30528和GSE30529相关数据,使用R语言和Perl软件获取差异基因;同时在通过GeneCards数据库获得DKD的靶点,将两者获得的核心靶点进行汇总得到最终的DKD靶点。在TCMSP数据库及文献资料中检索“龙杞方”中9味中药的有效成分和作用靶点。通过VENNY软件对获得龙杞方和DKD共同作用的交集靶点构建VENNY图,并通过Cytoscape 3.7.1构建“DKD-交集靶点-活性成分-龙杞方”网络可视化图,并获得龙杞方治疗DKD的主要成分;将交集靶点上传至STRING平台,获得PPI蛋白互作网络图,并通过R软件筛选出核心靶点;使用R软件对交集靶点进行GO和KEGG富集分析;最后对获得的主要成分和核心靶点进行分子对接验证分析。2.对获得核心靶点进行动物实验验证,将40只大鼠按照随机数字表法随机分为5组,其中正常组8只,造模组32只。对32只大鼠建立DKD大鼠模型;造模成功后,随机分为模型组,龙杞方高剂量组,中剂量组和低剂量组,每组各8只。模型组自造模起不做任何干预,其余3组组按照高剂量、中剂量、低剂量给龙杞方灌胃,连续给药8周。观察8周后大鼠的一般状态情况,检测大鼠的胰岛素、TBG、UALB、UACR;通过ELISA检测血清中炎症因子IL-6、TNF-α及MCP-1的水平;对大鼠处死后进行将右侧肾脏取出,进行切片予HE染色,观察其病理结构的变化;通过Western blot和qRT-PCR检测肾脏组织中IL-6、TNF-α、MCP-1及RAGE蛋白表达量和mRNA的表达量。结果:1.网络药理学通过GEO芯片数据库获得DKD肾小管和肾小球的芯片GSE30528和GSE30529,通过R语言筛选获得GSE30528差异基因542个,GSE30529差异基因484个;通过GeneCards数据库获得DKD靶点,设置筛选条件Relevance score≥50,获得165个DKD靶点。通过检索TCMSP平台只获取了三七、荷叶、葛根、川芎、枸杞、黄精的所有成分,按照OB≥30%,DL≥0.18的标准筛得其对应的有效成分,其中三七有效成分7个,荷叶有效成分14个,川芎有效成分6个,枸杞有效成分35个,葛根有效成分3个,黄精有效成分9个。其对应的中药靶点三七223个,川芎39个,枸杞321个,荷叶358个,葛根76个,黄精133个。红景天、地龙、生地黄通过文献检索,并通过Swiss ADME平台获得红景天有效成分47个,地龙有效成分36个,生地黄有效成分52个,核心靶点生地黄1008个,红景天1092个,地龙931个。将龙杞方和DKD获得的靶点上传至VENNY软件,获得交集靶点104个,其映射的主要有效成分有124个。对获得的交集靶点通过Cytoscape 3.7.1软件构建“DKD-交集靶点-活性成分-龙杞方”网络可视化图,并通过度值筛选获得主要成分有槲皮素、表没食子儿茶素没食子酸酯、山奈酚、金圣草素、麦黄酮、Dihomo-gamma-亚麻酸、廿二碳五烯酸、二氢辣椒碱、黄芩素、野菰酸;将交集靶点上传至STRING平台获得蛋白互作网络图,使用R语言绘制核心靶点图,其中度值最高的前6位为TNF、IL-6、AKT1、IL1β、TP53、VEGFA;使用R语言进行GO和KEGG分析,获得DKD密切相关的2069条生物过程、42条细胞成分、113条分子功能;获得151条DKD的信号通路,主要通路有糖尿病并发症AGEs-RAGE信号通路、缺氧诱导因子1信号通路、PI3K-Akt信号通路。使用autodock vina软件进行分子对接,筛选得到结合能最优构象。2.动物实验通过建立的DKD大鼠模型予以不同浓度的中药“龙杞方”干预,龙杞方高剂量组的大鼠一般状态优于中剂量、低剂量以及模型组;龙杞方高剂量组在TBG、胰岛素水平上均优于中剂量、低剂量以及模型组,有统计学意义;龙杞方高剂量组在蛋白尿改善方面,尿液中UALB、UACR均优于中剂量、低剂量以及模型组;发现使用高剂量的“龙杞方”干预可以有效改善DKD大鼠的状态、血糖及肾功能指标。本次实验肾脏组织病理观察发现,DKD大鼠的肾小管和肾小球的结构与正常组对比有明显变化,并存在大量的炎症细胞的浸润。在使用中药“龙杞方”干预后对肾小球和肾小管有明显改善作用,能有效抑制炎症因子,其中高剂量组效果最为明显。通过网络药理学获得的龙杞方治疗DKD的核心炎症靶点进行实验验证分析,通过ELISA检测血清中IL-6、TNF-α、MCP-1的水平,Western blot和qRT-PCR检测肾脏组织中IL-6、TNF-α、MCP-1及RAGE蛋白的表达量和mRNA的表达量,发现给予中药“龙杞方”能有效降低炎症水平,其中高剂量组最为显著。结论:1.通过GEO芯片、网络药理学研究发现,龙杞方治疗DKD的主要核心靶点为TNF、IL-6、AKT1、IL1β、TP53、VEGFA,主要有效成分为槲皮素、表没食子儿茶素没食子酸酯、山奈酚、金圣草素、麦黄酮、Dihomo-gamma-亚麻酸、廿二碳五烯酸、二氢辣椒碱、黄芩素、野菰酸,主要的信号通路为AGEs-RAGE、HIF-1、PI3K-Akt信号通路。说明龙杞方主要通过多个靶点、多种成分、多条信号通路对DKD起到肾保护作用。2.龙杞方可有效减低DKD大鼠肾功能损伤指标(UALB、UACR)以及血糖代谢指标(TBG、胰岛素);同时肾脏组织病理检查发现,龙杞方可减轻DKD大鼠肾组织的病理损伤,延缓肾小球硬化,说明龙杞方通过有效改善DKD大鼠的血糖代谢及尿蛋白水平,起到肾保护作用。3.通过血清ELISA、Western Blot蛋白表达和qRT-PCR mRNA基因检测IL-6、TNF-α及MCP-1。龙杞方可能通过抑制相关炎症因子作用起到对DKD大鼠肾脏保护作用。
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