非洲猪瘟病毒pO174L蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

作者：敬梦瑶; 牛庆丽; 杨吉飞; 吕欣倩; 樊洁; 赵亚茹; 杨赛霞; 张忠辉; 关贵全; 殷宏; 刘志杰^*

来源：中国兽医科学, 2022, 52(02): 177-183.

DOI：10.16656/j.issn.1673-4696.2022.0023

• 非洲猪瘟病毒
• pO174L蛋白
• 原核表达
• 多克隆抗体

为了解析非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）pO174L蛋白的功能，根据ASFV HLJ/18毒株基因序列（GenBank登录号：MK333180）设计引物，扩增O174L基因并克隆至pET-28a（+）载体中，构建原核表达载体p ET-28a-O174L，并将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，经IPTG诱导表达后，通过镍柱亲和层析纯化目的蛋白，利用SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定重组蛋白表达产物的抗原性，用重组蛋白免疫新西兰大白兔制备家兔抗pO174L蛋白的多克隆抗体；利用间接ELISA方法测定多克隆抗体的效价，并通过Western-blot和间接免疫荧光试验（IFA）鉴定多克隆抗体的特异性。结果显示，用PCR扩增的O174L基因片段长564 bp，与预期相符；双酶切和测序鉴定结果证明，重组质粒pET-28a-O174L构建成功，在原核表达系统成功地表达并获得了可溶性蛋白pO174L，分子质量约为21.5 ku；用纯化的蛋白免疫动物后制备了多克隆抗体，抗体效价达到1∶512 000;Western-blot和IFA结果显示制备的抗体能够特异性地识别ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞中表达的天然蛋白pO174L。本研究为深入解析pO174L蛋白的功能及其在ASFV感染和致病过程中的作用奠定了基础。

• 单位
  中国农业科学院兰州兽医研究所; 家畜疫病病原生物学国家重点实验室; 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心