肉牛DKK3基因3'UTR双荧光素酶报告质粒构建及与miR-25的靶向验证

作者：张凤; 陈明新^*

来源：中国畜牧杂志, 2022, 58(06): 135-140.

DOI：10.19556/j.0258-7033.20210721-03

• 肉牛
• miR-25
• DKK3
• 双荧光素酶

实验旨在鉴定miR-25与肉牛DKK3基因之间的靶向关系，为开展miR-25调控肉牛肌内脂肪生成的分子机制研究奠定基础。利用生物信息学分析软件TargetScan预测miR-25的潜在靶基因及结合位点，然后PCR扩增包含miR-25结合位点的肉牛DKK3基因3’非编码区（3’UTR）片段，构建DKK33’UTR野生型、突变型及删除型双荧光素酶报告基因质粒，并分别与miR-25 mimics和mimics NC共转染牛肾细胞（MDBK），检测双荧光素酶活性；此外，miR-25 mimics、mimics NC、miR-25 inhibitor、inhibitor NC分别转染MDBK细胞，荧光定量PCR和Western blot检测DKK3表达量。结果表明：TargetScan软件预测到miR-25具有包括DKK3在内的共944个潜在靶基因，且与DKK3结合的靶位点位于DKK3基因3’UTR的25～32 bp处；构建的3种质粒经双酶切后释放出大小约321 bp的条带，测序结果与预期一致，表明质粒构建成功；miR-25mimics可显著降低DKK3野生型质粒的双荧光素酶活性；过表达miR-25显著抑制DKK3表达，而抑制miR-25后DKK3的表达量显著上升。综上所述，本研究结果表明miR-25可靶向肉牛DKK3 3’UTR，并抑制其表达。

• 单位
  湖北省农业科学院畜牧兽医研究所