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摘要
目的构建一种新型10-23脱氧核酶（DZ）真核表达载体,并鉴定其在细胞内表达10-23DZ的能力以及10-23DZ抑制巨噬细胞TACO表达的效果。方法设计1条寡脱氧核糖核苷酸ODN-PSL,其序列包含鼠莫洛尼白血病病毒逆转录酶（MLV-RT）的引物结合序列、1个多克隆酶切位点（MCS）及1个逆转录终止信号序列。将ODN-PSL插入框架质粒pBUDCE4.1中启动子PCMV的下游,获取重组质粒pBUD-PSL。将MLV-RT的编码基因克隆至pBUD-PSL中另一启动子PEF-1α的下游,构建重组质粒pSDE01。将pSDE01转染人鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞,采用RT-PCR方法鉴定细胞中MLV-RT的表达及其表达产物的逆转录酶活性。通过计算机软件模拟巨噬细胞TACO mRNA的二级结构,以此确定10-23DZ的作用靶位并设计一相应的10-23DZ——DZ1,将DZ1表达序列插入pSDE01中ODN-PSL的MCS中,获取重组表达载体pSDE01-DZ1。将pSDE01-DZ1转染人RAW264.7细胞,并设未转染对照组。转染后48 h,采用PCR法和斑点杂交方法鉴定DZ1在细胞中的表达;并分别采用半定量RT-PCR和蛋白质印迹法检测TACO mPNA和蛋白的表达,各组实验均独立重复3次。结果限制性内切酶酶切及测序结果显示pSDE01构建成功,将其转染入RAW264.7细胞后检测到MLV-RT的表达,而且表达产物具有逆转录酶活性。pSDE01-DZ1转染入RAW264.7细胞后48 h,PCR和斑点杂交方法均检测到DZ1的表达;半定量RT-PCR和蛋白质印迹检测结果显示,与未转染组相比,pSDE01-DZ1转染后48 h巨噬细胞TACO mRNA表达水平下降了77.7%（0.193±0.008比0.864±0.005,P<0.05）,TACO蛋白表达量下降了73.3%（0.114±0.051比0.427±0.043,P<0.05）。结论成功构建了一种操作简便的新型10-23DZ表达载体,所携带的特异性10-23DZ可在细胞内有效表达,并抑制相应靶基因的表达。
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