科研之友
微信
新浪微博
Facebook
分享链接
摘要
基因克隆是解析基因功能的重要手段，但仍有很多基因难以克隆，比如高AT含量（>60%）基因组来源的DNA。ExoCET克隆技术通过联合核酸外切酶介导的体外同源重组和大肠杆菌RecET重组酶介导的细胞内同源重组，不仅能从微生物基因组中靶向抓取>100 kb的大片段，而且能高效组装>13个DNA片段，是基因克隆的有力工具，迄今未有利用ExoCET技术从AT含量>63%的基因组克隆大片段的报道。本研究以AT含量为69%的海洋单细胞光合蓝细菌原绿球藻MIT 9301菌株的基因组为研究对象，探究了利用ExoCET技术进行高AT含量基因组大片段克隆的最佳条件。结果显示：(1)在核酸外切酶介导的体外同源重组时使用Gibson体系较T4聚合酶体系能获得更高的克隆效率；(2)载体应选择单拷贝的细菌人工染色体（BAC），多拷贝质粒载体会导致克隆失败；(3)ExoCET可以从原绿球藻基因组上抓取>80 kb的大片段，并且能以100%的正确率组装11个3 kb的DNA片段；(4)可以一步同时抓取4个7～20 kb的基因组大片段。大规模基因组测序显示高AT含量生物占比超过30%，该研究建立的ExoCET-BAC策略将为高AT含量生物的基因组功能研究提供高效使能技术。
-
单位微生物技术国家重点实验室; 山东大学
