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摘要
目的探索定向排列的三维多孔网状(A型)结构和蜂窝煤状垂直贯穿的三维多孔网状(B型)结构对人工真皮血管化速率的影响。方法采用实验研究方法。本研究中的人工真皮为硅胶层和支架层双层结构, 根据支架层结构不同, 分为含A型结构和B型结构的人工真皮(以下分别简称A型真皮、B型真皮), 其中的A型结构和B型结构分别采用梯度冷冻干燥技术和物理制孔技术制得。采用扫描电镜观测2种真皮支架的微观形貌。采用比重瓶法测定2种真皮支架的孔隙率。参照国家医药行业标准中的方法, 于降解4、8、13、24 h测定2种真皮降解液及残留物中羟脯氨酸的含量, 反映2种真皮降解率。取L929细胞, 按照随机数字表法分为A型真皮组、B型真皮组、阴性对照组、阳性对照组, 阳性对照组加入含体积分数5%二甲基亚砜的MEM培养基, 阴性对照组加入高密度聚乙烯浸提液, 其余2组加入相应的浸提液培养24 h, 采用噻唑蓝试剂测定细胞增殖率, 并对细胞毒性进行定级。取L929细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVEC), 接种于预先置有2种真皮的孔板。接种后1、4、7、14 d, 采用免疫荧光法检测L929细胞在2种真皮支架表面的黏附生长状况。接种后7 d, 采用免疫荧光法和苏木精-伊红(HE)染色法检测前述2种细胞长入2种真皮支架的情况。在3只6个月龄雄性巴马小型猪背部两侧各制作3个5.0 cm×5.0 cm的全层皮肤缺损创面, 6列创面按照随机数字表法分为A型真皮两步法组、B型真皮两步法组和B型支架一步法组。A型真皮两步法组和B型真皮两步法组的创面分别先行A型真皮或B型真皮移植后, 再行自体刃厚皮片的移植, B型支架一步法组的创面行B型真皮(揭除硅胶层)+自体刃厚皮片一步法移植。大体观察Ⅱ期术后7 d A型真皮两步法组和B型真皮两步法组及Ⅰ期术后14 d B型支架一步法组的猪背创面出血、渗液和感染情况。同时, 采用透明胶片网格法测定自体皮移植面积并计算其存活率。Ⅰ期术后4、7、14 d, HE染色法检测3组猪背创面中支架的炎症细胞、成纤维细胞(Fb)和毛细血管浸润情况。Ⅰ期术后7 d, 免疫组织化学法进一步检测3组猪背创面中支架的血管化情况。Ⅰ期术后28 d、3个月, HE染色法检测A型真皮两步法组和B型支架一步法组猪背创面中支架的降解情况。对数据行单因素方差分析、独立样本t检验、Bonferroni校正。结果 A型真皮支架表面均匀分布着大量圆形和椭圆形的微孔, 纵切面可观察到柱状孔壁大体呈平行定向排列;B型真皮支架表面的蜂窝煤状贯穿大孔呈矩阵有序排列, 纵切面蜂窝煤状贯穿孔的孔壁由微孔相互连通成网络结构。A型真皮支架的孔隙率为(93.2±0.7)%, 与B型的(95.9±1.0)%相近(t=4.653, P>0.05)。A型真皮在4、8、13、24 h的降解率与B型真皮对应时间点的降解率相近(t=0.232、0.856、0.258、7.716, P>0.05)。培养24 h, A型真皮组、B型真皮组、阴性对照组L929细胞的增殖率显著高于阳性对照组(t=2 393.460、2 538.270、1 077.770, P<0.01);阳性对照组细胞毒性评级为4级, 其余3组为0级。接种后1、4、7、14 d, L929细胞和HUVEC在2种真皮支架中均呈时间依赖性增殖;且2种细胞在B型真皮上的黏附生长、增殖速率高于A型真皮。接种后7 d, L929细胞和HUVEC均已长满B型真皮支架层且至硅胶层一侧;而前述2种细胞向A型真皮内部迁移速度较慢, 硅胶层一侧仅见少量细胞。Ⅱ期术后7 d A型真皮两步法组和B型真皮两步法组及Ⅰ期术后14 d B型支架一步法组创面均未出现出血、渗液、感染等情况;3组各6个创面的自体皮植皮存活率均为100%。Ⅰ期术后4、7、14 d, 炎症细胞、Fb、毛细血管等逐渐向创面的支架层浸润, 且细胞浸润速率从高到低依次为B型支架一步法组、B型真皮两步法组、A型真皮两步法组。Ⅰ期术后7 d 3组创面中支架的血管化速率从高到低依次为B型支架一步法组、B型真皮两步法组、A型真皮两步法组。B型支架一步法组猪背创面中的支架在术后28 d逐渐溃散, 术后3个月完全降解;A型真皮两步法组猪背创面中的支架降解情况与前述相似。结论与A型结构相比, B型结构可加速人工真皮支架血管化进程, 利于联合自体刃厚皮一步法移植修复猪全层皮肤缺损创面。一步法移植的效果与分次移植人工真皮与自体刃厚皮的两步法一致, 可为创面治疗提供更优选择。
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