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摘要
目的:探讨丹皮酚对大鼠糖尿病视网膜病变(DR)的改善作用,并阐明其可能的作用机制。方法:40只SPF级SD大鼠随机分为对照组、DR模型组、15 mg·kg~(-1)丹皮酚组和30 mg·kg~(-1)丹皮酚组,每组10只,除对照组外其余3组大鼠腹腔注射55 mg·kg~(-1)链脲佐菌素(STZ)构建DR模型。建模成功后,对照组和DR模型组大鼠皮下注射8 mL·kg~(-1)生理盐水,15和30 mg·kg~(-1)丹皮酚组大鼠皮下注射15和30 mg·kg~(-1)丹皮酚磺酸钠注射液,每日1次,共2周。取大鼠视网膜组织用于实时荧光定量PCR (RT-qPCR)、Western blotting和酶联免疫吸附测定(ELISA)检测,HE染色观察各组大鼠视网膜组织病理形态表现。采用高糖(HG,33 mmol·L~(-1)葡萄糖)培养基培养人视网膜微血管内皮细胞(HRMECs)。采用不同剂量(0、5、25、50、70和100 mg·L~(-1))丹皮酚分别干预HRMECs和HG处理24 h后的HRMECs,采用CCK-8法和流式细胞术检测各组细胞活性和凋亡率,以确定后续实验中丹皮酚最适作用剂量。HRMECs进行转染后分为对照组、HG组、HG+NC inhibitor组、HG+miR-802-5p inhibitor组、 HG+丹皮酚(25 mg·L~(-1))组、 HG+丹皮酚+NC mimic组和HG+丹皮酚+miR-802-5p mimic组。采用RT-qPCR法检测各组大鼠视网膜组织和各组细胞中miR-802-5p表达水平,荧光素酶报告基因和RNA免疫共沉淀法检测HRMECs中miR-802-5p与SIRT6的结合关系,Western blotting法检测各组大鼠视网膜组织和各组细胞中沉默调节蛋白6 (SIRT6)、色素上皮衍生因子(PEDF)和血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达水平,ELISA法检测各组大鼠视网膜组织和各组细胞中活性氧(ROS)水平及过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果:与对照组比较,DR模型组大鼠视网膜组织中miR-802-5p表达水平和VEGF蛋白表达水平明显升高(P<0.01),SIRT6和PEDF蛋白表达水平明显降低(P<0.01),ROS水平明显升高(P<0.01),CAT和SOD活性明显降低(P<0.01);与DR模型组比较,不同剂量丹皮酚组大鼠视网膜组织中miR-802-5p表达水平和VEGF蛋白表达水平明显降低(P<0.05), SIRT6和PEDF蛋白表达水平明显升高(P<0.01),ROS水平明显降低(P<0.05或P<0.01),CAT和SOD活性明显升高(P<0.05或P<0.01)。HE染色,对照组大鼠视网膜组织结构清晰,内外核层细胞排列规则,未见新生血管生成;DR模型组视网膜组织结构不清晰,神经纤维层伴水肿,内外核层细胞排列疏松,有新生血管生成;不同剂量丹皮酚组大鼠视网膜组织结构较DR清晰,内外核层细胞排列较整齐,新生血管生成均较DR模型组有明显改善。与对照组比较,HG组细胞凋亡率升高(P<0.01);与HG组比较,HG+丹皮酚组细胞凋亡率明显降低(P<0.01)。与对照组比较,HG组细胞中miR-802-5p表达水平明显升高(P<0.01);与HG+NC inhibitor组比较,HG+miR-802-5p inhibitor组细胞中miR-802-5p表达水平明显降低(P<0.01)。荧光素酶报告基因分析和RNA免疫共沉淀检测,SIRT6是miR-802-5p的靶基因。与对照组比较,HG组细胞中SIRT6和PEDF蛋白表达水平及CAT和SOD活性明显降低(P<0.01), VEGF蛋白表达水平和ROS水平明显升高(P<0.01);与HG组比较,HG+miR-802-5p inhibitor组细胞中VEGF蛋白表达水平明显降低(P<0.01),SIRT6和PEDF蛋白表达水平明显升高(P<0.01),ROS水平明显降低(P<0.05),CAT和SOD活性明显升高(P<0.01);与HG组比较,HG+丹皮酚组细胞中ROS水平明显降低(P<0.01),CAT和SOD活性明显升高(P<0.01);与HG+丹皮酚+NC mimic组比较,HG+丹皮酚+miR-802-5p mimic组细胞中ROS水平明显升高(P<0.05),CAT和SOD活性明显降低(P<0.01)。结论:丹皮酚可能通过miR-802-5p/SIRT6轴对DR起到一定的改善作用。
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单位河南省中医院; 河南中医药大学
