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摘要
目的探讨肝母细胞瘤(hepatoblastoma, HB)肿瘤组织中信号转导与转录激活因子3(signal transducer and activator oftranscription 3, STAT3)高表达的DNA甲基化机制。方法以湖南省儿童医院普外一科于2016年5月至2019年3月收治的20例HB患儿为研究对象, 其中男12例, 女8例, 中位年龄为33个月, 年龄范围为3～72个月;3例甲胎蛋白含量<3 000 μg/L, 17例甲胎蛋白含量>3 000 μg/L;7例为胎儿型HB, 7例为胚胎型HB, 1例为未分化型HB, 5例为混合型HB;按HB的PRETEXT分期系统分期, Ⅰ期3例, Ⅱ期6例, Ⅲ期6例, Ⅳ期5例。手术切取HB肿瘤及癌旁正常组织, 肿瘤组织的切除范围参照术前影像学检查结果, 并扩大1～2 cm切除, 癌旁正常组织需切取离肿瘤边缘至少2 cm的正常组织。将肿瘤组织作为实验组, 癌旁正常组织作为对照组。采用实时定量聚合酶链反应(quantificational real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)及蛋白质印迹法检测实验组和对照组中STAT3和TET的表达水平。采用亚硫酸氢盐测序PCR(bisulfite sequencing PCR, BSP)技术检测实验组和对照组中STAT3启动子区DNA甲基化水平。使用染色质免疫共沉淀(chromatin Immunoprecipitation, ChIP)-定量聚合酶链反应(quantitative PCR, qPCR)检测实验组和对照组中STAT3启动子区TET1结合水平, 并将实验组中TET1结合水平与STAT3启动子DNA甲基化水平做相关性分析。结果在两组间STAT3的表达水平差异方面, qRT-PCR检测结果显示, 实验组与对照组STAT3的表达水平相比(8.43±5.05比1.03±0.41), 实验组STAT3的表达水平显著升高, 差异具有统计学意义(t=-6.53, P<0.001);蛋白质印迹法检测证实了实验组STAT3表达水平的上调, 实验组与对照组相比(0.96±0.17比0.37±0.13), 差异具有统计学意义(t=-12.13, P<0.001)。在两组间STAT3启动子DNA甲基化水平的差异方面, BSP检测结果显示, 实验组与对照组STAT3启动子区DNA甲基化水平相比(0.52±0.10比0.82±0.06), 实验组STAT3启动子区DNA甲基化水平显著降低, 差异具有统计学意义(t=11.73, P<0.001)。实验组的STAT3 mRNA水平与其启动子区DNA甲基化水平的相关性分析结果显示, STAT3 mRNA水平与其启动子区DNA甲基化水平呈显著负相关, 差异具有统计学意义(r=-0.704, P=0.001)。qRT-PCR检测显示实验组与对照组TET的表达水平相比(4.81±2.25比1.10±0.42), 实验组TET1表达水平明显上调, 差异具有统计学意义(t=-7.227, P<0.001);两组间TET2和TET3的表达差异无统计学意义, 实验组与对照组TET2表达水平为1.33±0.54比1.07±0.46(t=-1.624, P=0.113), TET3表达水平为1.77±1.03比1.33±0.89(t=-1.43, P=0.161)。蛋白质印迹法检测结果显示实验组与对照组TET1表达水平相比(0.77±0.18比0.27±0.09), 实验组TET1表达水平增加, 差异具有统计学意义(t=-11.392, P<0.001)。在两组间STAT3启动子区TET1的结合水平方面, ChIP-qPCR结果显示, 实验组与对照组相比(3.72±1.47比1.28±0.73), 实验组STAT3启动子区TET1结合水平显著升高, 差异具有统计学意义(t=-6.63, P<0.001)。实验组STAT3启动子区TET1结合水平与STAT3启动子区DNA甲基化水平的相关性分析结果显示, 实验组STAT3启动子区TET1结合水平与DNA甲基化水平呈显著负相关, 差异具有统计学意义(r=-0.658, P<0.01)。结论 HB患儿肿瘤组织中TET1的表达升高可能是导致STAT3启动子DNA低甲基化, 进而过度表达的原因之一。
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