杰氏棒杆菌L-天冬氨酸α脱羧酶半理性改造及全细胞催化合成β-丙氨酸

作者：刘浩; 马世杰; 周哲敏; 崔文璟^*

来源：生物技术通报, 2023, 39(09): 281-290.

DOI：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0085

• β-丙氨酸
• 虚拟突变
• 全细胞催化

β-丙氨酸是多个药物合成的重要砌块，可以通过天冬氨酸α脱羧酶（Pan D）催化L-天冬氨酸脱羧来合成，但普遍在用的Pan D酶活性不高是制约全细胞催化合成β-丙氨酸的瓶颈。因此，本研究通过酶的挖掘，选择将杰氏棒杆菌来源（Corynebacterium jeikeium）Pan D在Escherichia coli中异源表达。对杰氏棒杆菌来源Pan D进行Alaph Fold2建模和分子对接，采用Rosetta虚拟突变确定突变热点，结合薄层层析初筛和纯化后复筛，最终筛选到突变体L39A，其比酶活为13.45 U/mg，相比野生型酶的比酶活（9.6 U/mg）提升了1.4倍。酶学性质表征数据表明，野生型酶和L39A突变体最适p H均为6.5，且在p H 6.0-7.0之间酶活性稳定；两者最适温度为55℃，但L39A热稳定性较野生型提高；突变体酶的催化效率比野生型提升了1.4倍。对突变体进行结构解析发现，39位取代为侧链基团更小的丙氨酸，亲水性增强，增加了关键催化氨基酸58位酪氨酸与其他氨基酸的相互作用，使活性中心周围的区域稳定性提高，从而提高了催化活性。全细胞催化数据表明，在OD600=40的菌体浓度下，L39A在4 h能够转化70%的L-天冬氨酸，而野生型4 h仅能转化约50%,L39A在10 h能够转化90%L-天冬氨酸，在12 h能够完全转化1 mol/L的L-天冬氨酸，这种全细胞转化效率的提升在1.5 mol/L的底物条件下更加明显。本研究筛选到的突变体具有工业化应用潜力，建立了绿色、高效的β-丙氨酸生物合成法，为生物法大规模合成β-丙氨酸提供了重要的技术基础。

• 单位
  生物工程学院; 工业生物技术教育部重点实验室; 江南大学