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摘要
研究旨在克隆新的四氢嘧啶合成基因簇，并对其功能进行鉴定，为应用于四氢嘧啶的生产奠定基础。从新喀里多尼亚弧菌CGJ02-2中克隆获得四氢嘧啶合成基因簇ectABC,ectABC与表达载体pBAD连接后转化至大肠杆菌BW25113中，通过L-阿拉伯糖诱导表达。采用SDS-PAGE和液质联用鉴定重组表达蛋白，利用全细胞催化合成四氢嘧啶，通过高分辨质谱鉴定四氢嘧啶，并从天冬氨酸浓度、KCl浓度、温度和pH 4个方面优化催化条件。结果表明，来自新喀里多尼亚弧菌CGJ02-2基因组的ectABC大小为2 235 bp。SDS-PAGE显示表达产物中有3个重组蛋白产生,液质联用鉴定表明其分子量分别与ectA、ectB、ectC的理论分子量一致。高分辨质谱分析发现全细胞催化上清中有四氢嘧啶产生。优化后的最适全细胞催化条件为：天冬氨酸浓度100 mmol·L-1,KCl浓度100 mmol·L-1，温度30℃，pH 7.0，最优条件下产量为1.11 mg·mL-1。研究从弧菌中克隆了四氢嘧啶合成基因簇ectABC，并在大肠杆菌BW25113中实现了异源表达和低盐环境下的四氢嘧啶合成，为大规模发酵生产四氢嘧啶奠定了基础。
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