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摘要
通过定点突变技术，提高高丝氨酸脱氢酶(homoserine dehydrogenase,HSD)的催化活性，减少通路中代谢产物对其产生的反馈抑制和阻遏作用。对HSD与底物高丝氨酸分子进行对接，通过其空间结构分析，选择Asp61和Gly25两个关键位点进行定点饱和突变，通过酶活力筛选，发现突变体A61L和G25G较野生型(wild type,WT)酶活力显著提高。对这两个突变体进行酶动力学和酶学性质研究，结果显示：相较于WT,A61L和G25G的Km值降低，底物亲和力增强，酶活力分别提高到1.21、1.35倍；n值减小，正协同性增加；A61L和G25G最适温度与WT相同均为40℃；A61L最适pH值与WT相同为8.0,G25G最适pH值为8.5较WT提高；A61L和G25G酶活力半衰期较WT分别延长1 h和减少0.5 h；低浓度K+、Mg2+、Ca2+对突变体和WT有激活作用；不同体积分数甲醇、乙醇、乙腈和二甲基亚砜对突变体和WT有明显抑制作用；在1～25 mmol/L抑制剂浓度下，突变体受抑制作用较WT明显减弱。本研究获得酶活力提高、别构抑制减弱的突变体G25G和A61L，为优化HSD合成代谢途径和构建高产蛋氨酸、苏氨酸和异亮氨酸菌株提供了参考。
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