副溶血弧菌基因回补实验方法的建立与应用

作者：陈振鸿; 王丽; 张义全; 冯娇; 杨瑞馥; 常德; 安莉; 刘长庭; 周冬生^*

来源：南方医科大学学报, 2014, 34(01): 70-74.

• 副溶血弧菌
• 基因回补
• pBAD33
• aphA
• opaR

目的建立以pBAD33质粒为载体的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)基因回补实验平台。方法 PCR扩增aphA和opaR的整个ORF区序列,并将其直接克隆入pBAD33质粒中,构建重组质粒。分别将重组质粒转入到ΔopaR和ΔaphA中(分别代表opaR和aphA的突变株),以构建出相应的回补株C-ΔaphA和C-ΔopaR。分别在aphA和opaR基因内设计特异性引物,采用RT-PCR方法,验证在相应的回补突变株中aphA和opaR是否转录。利用引物延伸实验研究野生株(WT)、ΔopaR、ΔaphA、C-ΔaphA和C-ΔopaR中mfpA(aphA负调控,opaR正调控其表达)的相对RNA水平。结果 aphA和opaR在相应的回补株中发生转录;且mRNA水平与野生株一致。结论成功建立了以pBAD33质粒为载体的VP基因回补方法,并得到应用。

• 单位
  军事医学科学院; 重庆医科大学; 病原微生物生物安全国家重点实验室; 解放军总医院