产碱杆菌Alcaligenes sp.KS-85来源肌酸酶活性中心的关键氨基酸功能研究

作者：郝俊尧; 马富强; 杨广宇^*

来源：生物技术通报, 2021, 37(03): 75-83.

DOI：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0830

• 肌酸酶
• 活性中心
• 催化效率
• 分子对接
• 功能氨基酸

肌酸酶(Creatinase,EC 3.5.3.3)水解肌酸生成尿素和肌氨酸,是肌酐多酶级联检测中的关键酶。为进一步解析产碱杆菌来源肌酸酶的催化机理,利用蛋白质同源建模、分子对接、丙氨酸扫描技术分析了酶与底物的相互作用,并聚焦于酶活性中心4个功能未知的保守位点Phe64、Asp102、Phe252、Phe321,通过将氨基酸残基定点突变为6种具有代表性的氨基酸,结合生化实验对其功能进行解析。经研究,所有突变体的k_(cat)值大幅度降低;除6个突变体:F252A、F252S、F252Y、F252W、F321A、F321Y的K_M值降低,其余突变体的K_M均提高。结构分析表明Phe252通过与Tyr259形成的π-π堆积稳定酶-底物复合体;Asp102通过与Arg66,Gly322的氢键相互作用稳定酶反应的过渡态;Phe321,Phe64位于底物两侧,通过疏水侧链的排斥作用及空间位阻影响底物的定位。本研究通过对活性中心氨基酸残基的功能解析,为肌酸酶的催化机制解析和分子改造奠定了基础。

• 单位
  上海交通大学; 微生物代谢国家重点实验室; 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所; 生命科学技术学院