蓬乱蛋白2干扰和过表达慢病毒载体的构建及其在hUVECs中的表达

作者：生欣; 王俊华; 刘月华; 郜双林; 谢夏丹; 范芳

来源：中国现代医学杂志, 2019, 29(01): 15-22.

• 蓬乱蛋白2/Wnt蛋白质类
• 慢病毒载体
• 内皮细胞
• RNA干扰
• 过表达

目的获得蓬乱蛋白2(DVL2)基因干扰和过表达慢病毒表达系统,并在人脐静脉内皮细胞中(h UVECs)稳定表达。方法 (1)聚合酶链反应扩增目的基因,设计合成sh RNA,以慢病毒表达质粒为基础构建DVL2干扰和过表达载体,酶切电泳、实时荧光定量聚合酶链反应(q RT-PCR)和测序技术鉴定载体构建是否成功;(2)以3质粒系统在HEK293T细胞中包装病毒,通过荧光显微镜观察计数并计算病毒滴度;以嘌呤霉素筛选稳定转染的h UVECs,通过荧光显微镜观察计数获得转染效率。将感染好的细胞分为BC组(h UVECs空白对照)、NC组(HBLV-GFP-PURO阴性对照)、干扰组(pHB-shRNA-HDVL2)及过表达组(pHBLV-HDVL2)。(3)通过q RT-PCR与Western blotting检测分别从m RNA和蛋白表达水平验证目的基因的干扰和过表达水平。结果 (1)插入慢病毒表达载体的基因片段与目的基因的碱基序列完全一致。干扰序列峰形图为单峰,无突变。(2)病毒包装后,NC组、干扰组、过表达组滴度分别为2×108、2×108和1×108 TU/ml,感染人脐静脉内皮细胞的感染效率达98%。(3)干扰组DVL2的表达较BC组降低,差异有统计学意义(P <0.05),过表达组较BC组升高,差异有统计学意义(P <0.05),其中干扰效率为61%,蛋白质过表达水平为BC组的2.7倍。结论 DVL2基因干扰和过表达慢病毒载体构建成功,并能够在原代h UVECs中稳定表达。

• 单位
  生物化学教研室; 遵义医科大学; 基础医学院