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摘要
【目的】利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除anxa6基因的Caco-2细胞株，为研究大肠杆菌O157:H7效应蛋白Esp F与宿主膜联蛋白A6 （ANXA6）相互作用及其致病机制奠定基础。【方法】根据CRISPR/Cas9靶向原理设计并合成3个特异性识别anxa6基因的向导RNA （single guide RNA,sgRNA），基于Lenti CRISPRv2载体构建Lenti CRISPRv2-sg RNA重组质粒，转入293T细胞中，制备sgRNA-Cas9慢病毒，将慢病毒感染Caco-2细胞，经嘌呤霉素筛选阳性细胞，有限稀释法分离培养单克隆细胞，提取单克隆细胞基因组DNA，并对敲除位点附近的DNA片段进行PCR扩增，测序并进行脱靶效应评估；免疫印记法检测ANXA6蛋白表达情况，细胞计数试剂盒8 （cell counting kit 8,CCK8）试剂盒检测细胞增殖能力，免疫荧光法检测细胞紧密连接分布情况。【结果】Western blotting及序列测序表明anxa6基因敲除单克隆细胞构建成功；脱靶效应评估结果显示预测的10个脱靶位点均无脱靶现象；基因敲除对细胞增殖能力无明显影响；免疫荧光结果显示，Caco-2及Caco-2anxa6-/-细胞紧密连接蛋白ZO-1均沿细胞膜连续分布，结构完整，转染EspF质粒后出现分布不完整、缺口等现象。【结论】成功构建anxa6基因稳定敲除的Caco-2细胞株，初步探索ANXA6蛋白在紧密连接分布中的作用，为进一步研究大肠杆菌O157:H7通过EspF-ANXA6互作介导宿主肠屏障损伤分子机制提供技术支撑。
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单位公共卫生学院; 南方医科大学; 南方医科大学南方医院
