慢病毒介导Ras-GRF1调控肝癌干细胞干性维持与自我更新能力的机制

作者：宫东伟; 邢贻雷; 王开琼; 黄涛; 郑进方^*

来源：现代肿瘤医学, 2022, 30(17): 3076-3082.

DOI：10.3969/j.issn.1672-4992.2022.17.003

• Ras蛋白特异性的鸟苷酸释放因子1
• 肝癌干细胞
• 细胞干性
• 自我更新

目的:探究Ras蛋白特异性的鸟苷酸释放因子1(Ras protein specific guanylate releasing factor 1,Ras-GRF1)在肝癌干细胞(cancer stem cells, CSC)生物学特性及自我更新中的作用，并初步探究其作用机制。方法:实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测人正常肝细胞系(HL-7702)和不同肝癌细胞系(Huh7、HepG2、Hep3B、CLC4、CLCl3、SMMC-7721)中Ras-GRF1表达水平；流式细胞术分选出肝癌干细胞，利用Ras-GRF1-pCMV6-GFP重组慢病毒感染肝癌干细胞，MTT法、EdU染色和平板克隆形成实验检测过表达Ras-GRF1对肝癌干细胞增殖能力的影响；Transwell小室实验检测过表达Ras-GRF1后肝癌干细胞迁移与侵袭变化;成球实验检测过表达Ras-GRF1后肝癌干细胞的自我更新能力;蛋白免疫印迹(Western blot)检测肿瘤干细胞中Hippo信号通路关键蛋白大肿瘤抑制因子(large tumor suppressor,LATS)、Yes协同蛋白(Yes cooperative protein,YAP)和哺乳动物STE20样蛋白激酶(mammalian STE20-like protein kinase,MST)的蛋白及磷酸化表达水平。结果:不同肝癌细胞中Ras-GRF1 mRNA表达量较人正常肝细胞中显著降低(P <0.05);分离到的肝癌干细胞在感染Ras-GRF1-pC MV6-GFP重组慢病毒后，细胞中RasGRF1 mRNA表达量显著升高，差异具有统计学意义(P <0.05);在两种肝癌干细胞HepG 2-CSC和SMMC-7721-CSC中，相较于空白对照组，Ras-GRF1-pC MV6组细胞增殖活性显著降低，EdU阳性染色数目和细胞克隆形成数目均显著减少，细胞迁移与侵袭数目也均显著减少，细胞成球能力明显降低，p-LATS/LATS、pYAP/YAP及p-MST/MST蛋白表达显著增加，差异均具有统计学意义(P <0.05)。结论:通过慢病毒介导Ras-GRF1在肝癌干细胞中过表达后，能够抑制肝癌干细胞的增殖、迁移与侵袭，降低自我更新能力，其机制可能与调控Hippo信号通路相关。

• 单位
  河南省肿瘤医院; 海南省人民医院