粪便和组织样本高通量测序前处理方法的评估

作者：马晓华; 柴萨萨; 李利利^*; 郑贵森^*; 段招军

来源：中华实验和临床病毒学杂志, 2022, 36(01): 103-110.

• 高通量测序
• 病毒
• 前处理
• 方法学
• 粪便
• 组织

目的优化和评估粪便和组织样本高通量测序前处理方法, 提高高通量测序在宏病毒组研究中的灵敏度。方法针对粪便样本, 选取经粪便排毒的5种病毒阳性样本混合模拟样本, 对不同材质的滤器、核酸酶不同处理时间、不同的提取核酸方法进行评价。针对组织样本, 选取动物组织中检出的2种病毒阳性样本, 对过滤、核酸酶处理和不同的核酸提取方法进行评价。采用TaqMan real-time PCR定量方法评价每步处理对每一种模式病毒核酸载量的影响, 采用SYBR Green real-time PCR方法对细菌16S rRNA基因和宿主12S rRNA基因进行定量以评价细菌和宿主的去除效果。结果对于粪便样本, 使用0.22 μm的PES滤器过滤效果较好, 使用PVDF材质滤器导致样本量减少;核酸酶消化2 h比消化1 h去除细菌的效果更好, 且病毒损失较少;使用RPMK试剂盒可以有效减少细菌, 但对部分病毒提取效果较差, 而MVSK试剂盒提取病毒核酸效果较好。对于组织样本, 使用0.22 μm的PES滤器过滤病毒损失较少;核酸酶消化1 h可以有效去除宿主gDNA, 且病毒损失较少;使用VNAEK II试剂盒提取病毒核酸效果最好, Trizol LS+RPMK方法去除宿主gDNA效果较好, 但病毒损失较大。粪便和组织样本的前处理方法整个流程的病毒损失分别为(1.7-3.0)Ct和(1.6-2.5)Ct。结论粪便样本最佳方法为PES滤器过滤、核酸酶消化2 h、MVSK试剂盒提取核酸;组织样本最佳方法为PES滤器过滤、核酸酶消化1 h、VNAEK II试剂盒提取核酸。

• 单位
  中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所; 甘肃中医药大学; 公共卫生学院