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摘要
目的应用自行设计的灌注脱细胞系统制备全膀胱脱细胞基质(BAM), 并探讨采用脂肪干细胞(ADSCs)构建组织工程膀胱的可行性。方法本研究于2020年10月至2021年4月进行。采用自行设计的膀胱灌注脱细胞系统, 按照灌注液流动方向和不同脱细胞液作用时间的不同, 制订4种不同的脱细胞方案(分别为A、B、C、D组)。其中A组和B组均以膀胱组织的尿道口作为灌注液的流出道, C组和D组剪去膀胱顶部部分组织以膀胱顶部开口作为灌注液的流出道。A组和C组采用1% Triton X-100作用6 h, 1%十二烷基硫酸钠(SDS)作用2 h;B组和D组采用1% Triton X-100作用7 h, 1% SDS作用1 h。另设正常膀胱组作为对照, 其组织为直接取材的天然膀胱组织, 不需要灌注和冷冻保存。通过HE、DAPI、Masson三色染色和阿尔新蓝染色, 以及试剂盒定量分析以筛选出快速且高效的脱细胞方案, 制备全膀胱支架。以制备的BAM为支架材料, ADSCs为种子细胞构建组织工程膀胱, HE和DAPI染色观察ADSCs在BAM上的分布情况。结果 HE和DAPI染色结果显示C组未见明显的细胞核残留, Masson三色染色和阿尔新蓝染色结果表明C组的胶原结构和糖胺聚糖得到较好保留。C组膀胱壁厚度与正常膀胱组[(975.44±158.62)μm与(1 064.49±168.52)μm]差异无统计学意义(P>0.05)。C组DNA含量[(43.59±4.59) ng/mg ]明显低于正常膀胱组、A组、B组和D组[分别为(532.50±26.69)、(135.17±6.99)、(182.49±13.69)、(84.00±4.38)ng/mg], 差异均有统计学意义(P< 0.05)。C组胶原含量[(10.98±0.29)μg/mg]和糖胺聚糖含量[(2.30±0.18)μg/mg]与正常膀胱组[(11.69±0.49) μg/mg和(2.36±0.09)μg/mg]比较, 差异均无统计学意义(P>0.05)。扫描电镜检查结果显示A～D组制备的BAM表面可见大量的孔隙结构, 利于细胞黏附。分离培养ADSCs, 流式细胞术鉴定证实CD90和CD29阳性表达, CD45和CD106阴性表达。活/死细胞双染色法和CCK-8检测证实C组制备的BAM无细胞毒性。以C组BAM为支架材料构建组织工程膀胱, HE和DAPI染色可见大量ADSCs分布于组织工程膀胱的表面和内部。结论采用自行设计的灌注脱细胞系统制备的全膀胱形态BAM可作为膀胱组织工程的支架材料, 构建的组织工程膀胱可用于膀胱修复重建, 为进一步临床转化研究提供实验基础。
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单位解放军总医院
